大鼠肺泡上皮细胞的相关研究

背景及概述^[1]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面；一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。大鼠肺泡上皮细胞为内皮细胞的一种。

相关研究^[2-3]

有研究建立高浓度氧诱导在体大鼠肺泡细胞凋亡损伤模型，观察短时间内（4～8小时）吸入高浓度氧肺泡上皮细胞的损伤；观察一氧化氮及其合酶对急性吸入高浓度氧导致大鼠肺泡上皮细胞凋亡的影响；探讨线粒体途径和细胞酸化在氧化应激早期诱导的肺泡上皮细胞凋亡信号传导过程中的作用。将WISTAR大鼠放至于氧浓度为80－100％的氧箱中4、8、12、16小时，空气对照组放置于氧浓度为21％的氧箱中，实验分三部分，按实验目的不同制取样本做如下测试：1.比色法测定血浆、肺组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD）、谷光甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）和总抗氧化能力（T-AOC）；HE染色观察肺组织常规病理变化，TUNEL染色法检测肺泡表面凋亡细胞；2.Westernblot检测肺组织中eNOS和iNOS蛋白表达，RT-PCR检测eNOSmRNA、iNOSmRNA的表达。3.RT-PCR检测bcl-2mRNA、baxmRNA、eNOSmRNA、iNOSmRNA的表达，Westernblot检测bcl-2、bax、Akt1/磷酸化-Akt1、mTOR/磷酸化-mTOR的蛋白表达；BCECF-AM检测细胞浆pH值，流式细胞仪(Flowcytometry，FCM)检测细胞增殖指数。结果：1.与对照组相比（凋亡2.17%），吸入高浓度氧4小时即出现典型的肺泡表面凋亡细胞(9.13±3.2％)，8～12小时组凋亡细胞的数量明显增加(17.47±3.5％、19.22±4.5％)，16小时组有减少的趋势(11.03±2.8％)。

HE染色切片显示4小时组肺轻度充血，8小时组肺毛细血管扩张、充血、红细胞渗出、轻度肺水肿。16小时组开始出现以中性粒细胞为主的炎症细胞，肺组织水肿明显、肺大泡和肺不张，甚至可见肺组织增生、结构紊乱。各组血清、肺组织匀浆MDA、NO、NOS显著升高（P＜0.01），而SOD、GSH、CAT、T-AOC均显著降低（P＜0.01）。2.Westenblot检测发现，高氧4h组eNOS表达开始升高，8h、12h组后eNOS蛋白质表达升高明显，16h组高表达但略有下降；高氧各组eNOSmRNA表达显著增高。对照组iNOS蛋白微量表达，与对照组比较，4h、8h、12h组表达无显著差异，表达量远低于eNOS，16h组表达略增强；iNOSmRNA的表达在16h组表达也增强。3.RT-PCR检测发现吸氧各组bcl-2mRNA表达明显降低，baxmRNA表达显著增高；Westernblot检测Bax蛋白表达逐渐增强，Bcl-2蛋白、AKT-1/PhosphoAkt-1(Ser473)蛋白、mTOR/Phospho-mTOR蛋白表达逐渐减弱；高氧氧应激后大鼠肺泡上皮细胞Akt/PKB蛋白磷酸化程度都降低，随吸氧时间延长，Akt/mTOR信号转导蛋白表达降低更加明显；BCECF-AM检测细胞浆pH值显示随着吸氧时间的延长，体内ROS水平的不断升高，FL1/FL2比值不断降低，凋亡的比例也不断增加。各时段细胞酸化均较显著，各组细胞增殖改变和细胞浆酸性变化趋势相一致。

有研究探索姜黄素对慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)大鼠肺泡上皮细胞内质网应激的调节作用。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、COPD模型组、姜黄素干预组和溶剂对照组，采用香烟烟熏联合气管内注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，并按照分组情况对大鼠进行干预。干预结束后计数支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中的细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量，HE染色观察肺组织病理学改变，透射电子显微镜观察大鼠肺泡上皮细胞内质网形态，免疫组织化学法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，GRP78)在大鼠肺泡上皮细胞中的表达水平。结果与正常对照组比较，COPD模型组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量均显著升高(P<0.05)；姜黄素干预组大鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞数量较COPD模型组降低(P<0.05)。光镜和透射电子显微镜观察显示COPD模型组大鼠肺泡腔扩张、肺泡上皮细胞内质网肿胀，姜黄素干预可减轻肺泡上皮细胞及内质网损伤。与正常对照组相比，GRP78在COPD大鼠肺泡上皮细胞中表达水平显著升高(P<0.05)；姜黄素干预可显著下调GRP78在COPD大鼠肺泡上皮细胞中表达水平(P<0.05)。结论姜黄素可能通过抑制大鼠肺泡上皮细胞内质网应激而发挥对COPD的保护作用。

原来培养^[1]

（1）取怀孕18天SD大鼠，腹腔注射巴比妥钠麻醉，喷适量75%酒精消毒，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出胎鼠（大鼠子宫为V字形，剥离时可将整个子宫全部取出，再将胎鼠逐一取出）。

（3）PBS冲洗三次，无菌条件下取出胎鼠肺组织，放入提前加入培养基并且放在冰袋上的培养皿中。

（4）PBS洗三次，将培养皿放于提前准备好的冰袋上。将取出的肺组织剪碎后加入6mL胰酶溶液消化25min（注意这里是胎鼠肺组织，所以消化时间较短，如果为新生鼠肺组织需延长消化时间到40-60min左右，请悉知），加入等量DMEM培养基终止消化。

（5）200目滤网过滤，去除剩余的组织碎片。

（6）将细胞悬液转移到离心管中，1000r/min离心，弃去上清。

（7）加入适量DMEM培养基成悬细胞，接种于六孔板中，放入37℃，5%CO2孵箱中培养。

（7）36h后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。

（8）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

大鼠肺泡上皮细胞原代培养过程中，约36小时即可出现贴壁生长，细胞呈梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。大鼠肺泡上皮细胞细胞图片：

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 急性高氧氧应激过程中大鼠肺泡上皮细胞凋亡的损伤机制探讨

[3] 姜黄素对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞内质网应激的影响