KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系是一种用于研究人神经胶质瘤的实验细胞系。这种细胞系是通过将人神经胶质瘤组织种植在培养瓶内，并经过一定的培养条件而形成的。

KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系具有以下特点：

生物学特性：KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系保持了源自肿瘤组织的生物学特性，包括细胞的形态、生长方式、基因表达等方面。这种细胞系可以用于研究神经胶质瘤的发生、发展、治疗及药物筛选等方面的实验。

培养条件：KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系需要在一定的培养条件下生长，如适当的温度、湿度、营养物质等。研究人员需要根据细胞系的生长特性，定期更换培养液，以保证细胞的正常生长和实验的准确性。

实验用途：KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系广泛应用于神经科学、肿瘤学、药理学等领域的研究。通过这种细胞系，可以研究神经胶质瘤的细胞生物学行为、探索肿瘤发生发展的机制、筛选抗肿瘤药物等。

安全性：KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系是一种实验细胞系，需要在生物安全柜内进行操作，以防止交叉污染和意外感染等风险。研究人员需要遵守相关的实验室安全规定，确保实验过程的安全性。

KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系

KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系可以用于重组人tau蛋白对体外培养的神经细胞的毒性作用

观察重组人tau蛋白是否具有细胞毒作用,并探讨该作用是否与其诱导内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激有关。

方法:将原核表达纯化的重组人tau蛋白加入神经来源的KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系和原代培养的大鼠神经元培养液中,通过倒置显微镜观察细胞形态、MTT法检测细胞增殖活性、TUNEL染色观察细胞凋亡情况、PI染色检测死细胞数量、免疫荧光染色法观察内质网应激标志性蛋白CHOP及内质网应激上调蛋白ARMET的表达情况。

结果:1.重组人tau对KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞生长有抑制作用在人神经母细胞瘤细胞株KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞的培养上清液中加入重组人tau蛋白,并用相同浓度的BSA和重组人ARMET作为对照。连续作用5 d后,在倒置显微镜下观察细胞形态。结果发现,加入BSA和重组人ARMET的细胞生长良好,而加入重组人tau蛋白的细胞,生长缓慢,部分细胞变圆变小,非贴壁细胞数目增多。结果表明重组人tau蛋白对KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞的生长有抑制作用。

2. 重组人tau蛋白诱导KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞死亡具有时间和剂量依赖性在细胞培养上清液中加入重组人tau蛋白并用相同浓度的BSA和重组人ARMET作为对照,观察24 h、48 h、72 h、5 d时细胞死亡情况。通过DAPI和PI染色观察发现,当处理时间为24 h时,与BSA组相比,重组人tau组KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞死亡数目显著增加(p﹤0.05)。从处理时间为48 h开始,这种差异逐渐增大(p﹤0.01),故选用处理时间48 h,来继续观察不同浓度的tau蛋白对KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞死亡的影响。与BSA组相比,当tau蛋白浓度为0.1μg/ml时,即开始促进KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞死亡(p﹤0.05),当tau蛋白浓度上升为0.25μg/ml时,作用更明显(p﹤0.01)。可见,重组人tau诱导KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞死亡具有时间和剂量依赖性。

3.重组人tau蛋白诱导的KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞凋亡在KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞培养上清液中分别加入BSA、tau及ARMET,持续作用5 d,然后进行DAPI和TUNEL染色。结果发现,用BSA和ARMET处理的细胞,大部分细胞的核基本正常,TUNEL染色阳性细胞很少;而加入tau的细胞,胞核变小,染色质凝聚,细胞中出现了大量的TUNEL染色阳性细胞。上述结果提示重组人tau蛋白可诱导KNS-81人神经胶质瘤贴壁细胞系细胞凋亡。

参考文献

[1]Armet,a UPR-upregulated protein,inhibits cell proliferation and ER stress-induced cell death[J].Andria Apostolou;;Yuxian Shen;;Yan Liang;;Jun Luo;;Shengyun Fang.Experimental Cell Research,2008(13)

[2]Regulation of Phosphorylation of tau by Protein Kinases in Rat Brain[J].Amitabha Sengupta;;Inge Grundke-Iqbal;;Khalid Iqbal.Neurochemical Research,2006(12)

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[4]Acute anoxia induces tau dephosphorylation in rat brain slices and its possible underlying mechanisms[J].RongLiu;Jin‐JingPei;Xiao‐ChuanWang;Xin‐WenZhou;QingTian;BengtWinblad;Jian‐ZhiWang.Journal of Neurochemistry,2005(5)

[5]张晶晶.重组人tau蛋白对体外培养的神经细胞的毒性作用[D].安徽医科大学,2010.