LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系建立于1979年，从一名60岁的右额叶顶叶-枕叶胶质母细胞瘤女性白人患者中获得。LN229细胞系有一个野生型PTEN基因、突变的p53基因，可能在p16和p14ARF肿瘤抑制基因中存在纯合子缺失。常用于胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等机制研究。

LN229为贴壁细胞，上皮细胞样，可在裸鼠中形成肿瘤，该细胞STR鉴定结果无误，且支原体检测阴性。

LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系

LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系培养步骤

一、复苏LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

二、LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

b）、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

三、LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

应用^[4][5]

LN-229人脑髓母细胞瘤贴壁细胞系可以用于PEITC对神经胶质瘤LN229细胞凋亡影响及机制的研究

探索苯乙基异硫氰酸酯对人类神经胶质瘤细胞LN229的生长影响极其影响机制,为将苯乙基异硫氰酸酯应用到预防和治疗人神经胶质瘤提供依据。

方法：本研究的研究对象是人神经胶质瘤LN229细胞,利用MTT试验检测PEITC对肿瘤细胞的生长和增殖的影响。MTT是一种黄色染料。在细胞线粒体内含有的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的共同作用下,MTT被代谢还原为蓝紫色且不溶于水的甲臜,通过测定490 nin处甲躜的含量就可推测活细胞的数量。

通过Annexin-V-FITC/PI流式细胞术分析PEITC对神经胶质瘤细胞周期和细胞凋亡的影响。Annexin-V是一种依赖于Ca2+的磷脂结合蛋白,当在Ca2+存在条件下,Annexin-V可以与细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合,使磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外标志着细胞凋亡的开始；PI是一种DNA染料,当细胞进入凋亡晚期后,细胞膜的通透性会发生变化,此时PI进入细胞并与细胞内的DNA结合,因此,通过Annexin-V/PI双染色法就可以检测到细胞凋亡,分析细胞内的DNA含量的不同研究细胞周期的变化。

利用DCFH-DA探针法检测肿瘤细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的表达水平。DCFH-DA探针是用于特异的鉴定细胞内ROS含量,其可以穿过细胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH,而细胞内的ROS可以将无荧光标记的DCFH转变为有荧光标记的DCF。所以,通过检测细胞内DCF的荧光强度就可以鉴定细胞内ROS的水平变化。

同时通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELI SA)检测用PEITC处理后,肿瘤细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。采用western blot法检测含半胱氨酸的天冬氨酸酪蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)活性的变化。结果：当PEITC作用于神经胶质瘤LN229细胞72小时后,细胞的生长受到显著抑制,且这种抑制作用具有PEITC浓度依赖性(IC50=20uM)。

结果还显示,当浓度分别为10μM和20μM的PEITC时,PEITC对细胞生长的抑制率较高,而且对正常细胞表现出无毒或弱毒性。因此,在接下来的研究中本文选择的PEITC浓度分别为10μM和20μM。流式细胞术分析PEITC对神经胶质瘤LN229细胞凋亡的影响,结果显示：分别用10μM和20μM的PEITC处理LN229细胞24小时后,对照组的细胞凋亡率仅为5%；10 gM的PEITC处理后细胞凋亡率为30.3%(P<0.05)；而20μM的PEITC处理后细胞凋亡率高达64.9%(P<0.05)。同时,流式细胞术分析结果还显示处于G2/M期的细胞比例明显上升,而G0/G1期的细胞比例明显下降(P<0.05)。

对ROS表达水平的检测结果显示101μMPEITC组细胞的ROS表达量比对照组高4倍,而20μM PEITC组细胞的ROS表达量比对照组高6倍,且统计分析具有统计学意义(P<0.05)。

此外,用10μM和20μM的PEITC分别处理LN229细胞24小时后,肿瘤细胞内GSH和SOD的表达水平明显降低。10μM PEITC组20μM PEITC组细胞内的GSH表达量与对照组细胞GSH表达量相比仅为69.3%和42.4%(P<0.05)；而10μM PEITC组和20μM PEITC组细胞内的SOD表达量与对照组细胞SOD表达量相比仅为60.7%和20.6%(P<0.05)；而且肿瘤细胞内caspase-3的活性与对照组(β-actin)相比显著增加(P<0.05)。

参考文献

[1]Sulforaphane,a cancer chemopreventive agent,induces pathways associated with membrane biosynthesis in response to tissue damage by aflatoxin B 1[J].Nirachara Techapiesancharoenkij;;Jeannette L.A.Fiala;;Panida Navasumrit;;Robert G.Croy;;Gerald N.Wogan;;John D.Groopman;;Mathuros Ruchirawat;;John M.Essigmann.Toxicology and Applied Pharmacology,2015(1)

[2]Phenethyl isothiocyanate:A comprehensive review of anti-cancer mechanisms[J].Parul Gupta;;Stephen E.Wright;;Sung-Hoon Kim;;Sanjay K.Srivastava.BBA-Reviews on Cancer,2014(2)

[3]Molecular targets of isothiocyanates in cancer:Recent advances[J].Parul Gupta;;Bonglee Kim;;Sung‐Hoon Kim;;Sanjay K.Srivastava.Mol.Nutr.Food Res.,2014(8)

[4]Sulforaphane reduces the alterations induced by quinolinic acid:Modulation of glutathione levels[J].R.A.Santana-Martínez;;S.Galván-Arzáte;;R.Hernández-Pando;;M.E.Chánez-Cárdenas;;E.Avila-Chávez;;G.López-Acosta;;J.Pedraza-Chaverrí;;A.Santamaría;;P.D.Maldonado.Neuroscience,2014

[5]苏吉春.PEITC对神经胶质瘤LN229细胞凋亡影响及机制的研究[D].山东大学,2016.