小鼠神经束膜细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠神经束膜细胞分离自小鼠神经束膜组织的原代细胞，只要用于神经束膜的细胞模型研究。

神经束膜为神经中保护性结缔组织的第二层，为一光滑透明的薄膜，将神经纤维分隔成束。神经束膜可轻易地与其包覆的神经纤维分离，以管状外鞘的形式独立出来。神经束膜外层为结缔组织，内层则由大约7~8层扁平上皮细胞所组成，称为神经束膜上皮(perineurial endothelium)。神经束膜性质强韧、不易被针穿透，此点与神经外膜不同。

小鼠神经束膜细胞

细胞培养步骤：

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备ECM培养基；优质胎牛血清，5%；添加对应因子；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加6mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜。第二天检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含6ml培养基瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于毛囊神经嵴干细胞对神经束膜细胞的作用及机制研究

采用“限时消化-差速贴壁-化学药物”纯化方案,培养获得高纯度的神经束膜细胞,同时培养大鼠触须垫hfNCSCs,建立hfNCSCs和神经束膜细胞的共培养体系,探索hfNCSCs对神经束膜细胞增殖和迁移的作用。此外,对hfNCSCs外泌体（hfNCSCs exosomes,hfNCSCs-Exos）进行提取、鉴定,以hfNCSCs-Exos作用于神经束膜细胞,测序分析hfNCSCs-Exos micro RNA靶基因的生物学功能及通路,探讨hfNCSCs促进神经束膜细胞增殖及迁移的可能机制,以期为提高神经束膜细胞的增殖和迁移能力提供重要的理论基础及实验依据。部分神经束膜细胞及hfNCSCs的分离、培养、纯化及鉴定目的:体外获取活性强、纯度高的神经束膜细胞及hfNCSCs,为周围神经损伤修复的研究提供稳定的细胞来源。

方法:神经束膜细胞的分离、培养、纯化及鉴定:取100g左右的Sprague-Dawley（SD）大鼠,取其坐骨神经,仔细剥除神经外膜及神经纤维获取神经束膜。将神经束膜放入Collagen I包被的培养板,于孵箱内37℃、5%CO2贴块1h,之后添加神经束膜细胞的完全培养基。

10d后去除组织块,采用“限时消化-差速贴壁-化学药物”纯化方案对细胞进行纯化:将细胞用0.25%含EDTA胰酶处理10s以去除施万细胞,将剩余细胞制成细胞悬液放入培养瓶内,于37℃、5%CO2培养30min以初步去除成纤维细胞,转移细胞悬液至新培养瓶。3d后重复上述步骤。重新接种细胞24h后,添加100μmol/L阿糖胞苷处理细胞24h,去除剩余的成纤维细胞,2d后取细胞进行免疫细胞化学鉴定,Claudin-1标记神经束膜细胞,S100标记施万细胞,vimentin标记成纤维细胞。hfNCSCs的分离、培养及鉴定:取50g左右的雄性SD大鼠,解剖大鼠触须垫毛囊,获得毛囊隆突部,放入Collagen I包被的培养板中37℃、5%CO2贴块30min,之后添加hfNCSCs完全培养基。

取23代细胞进行免疫细胞化学鉴定,nestin标记hfNCSCs,S100标记施万细胞,Tuj标记神经元。

结果:1.神经束膜细胞免疫细胞化学染色结果显示,未经纯化的细胞中,Claudin-1阳性率为42.33%,vimentin阳性率为50.33%,S100阳性率为15%;经“限时消化-差速贴壁”纯化后,Claudin-1阳性率为65%,vimentin阳性率为37.66%,S100为阴性;经“限时消化-差速贴壁”+100μmol/L阿糖胞苷纯化的细胞,Claudin-1阳性率为97.66%,vimentin阳性率为5.66%,S100为阴性。

2. hfNCSCs免疫细胞化学染色结果显示,nestin阳性率为96%,而几乎没有细胞表达S100和beta III Tubulin。

结论:采用“限时消化-差速贴壁-化学药物”纯化方案可获得纯度较高和生长状态良好的神经束膜细胞;所培养获得的hfNCSCs大部分处于未分化状态,保持良好的干性。

参考文献

[1]DNMT1-mediated methylation inhibits microRNA-214-3p and promotes hair follicle stem cell differentiate into adipogenic lineages[J].Fangcao Jin,Min Li,Xuyang Li,Yunpeng Zheng,Kun Zhang,Xiaojun Liu,Bingjie Cai,Guangwen Yin.Stem Cell Research&Therapy.2020(1)

[2]Melatonin exerts neuroprotective effects by inhibiting neuronal pyroptosis and autophagy in STZ-induced diabetic mice.[J].Che Hui,Li Hui,Li Yang,Wang YueQiu,Yang ZhenYu,Wang RuiLing,Wang LiHong.FASEB journal:official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology.2020

[3]Effect of exosomes from adipose-derived stem cells on the apoptosis of Schwann cells in peripheral nerve injury.[J].Liu Cai-Yue,Yin Gang,Sun Yi-Dan,Lin Yao-Fa,Xie Zheng,English Arthur W,Li Qing-Feng,Lin Hao-Dong.CNS neuroscience&therapeutics.2020(2)

[4]Adipose Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Induce Proliferation of Schwann Cells via Internalization[J].Maximilian Haertinger,Tamara Weiss,Anda Mann,Annette Tabi,Victoria Brandel,Christine Radtke.Cells.2020(1)

[5]于皓杰.毛囊神经嵴干细胞对神经束膜细胞的作用及机制研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2021.