人膜间皮细胞

1）准备Medium 199培养基(添加NaHCO3 1.5g/L,3.3 nM EGF，400 nM氢化可的松，870 nM牛胰岛素，20 mM HEPES，3.87µg/L H2SeO3)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）人膜间皮细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）人膜间皮细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

将含有1mL人膜间皮细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有人膜间皮细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查人膜间皮细胞密度。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人膜间皮细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人膜间皮细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。