Y2HGold感受态细胞的应用

背景^[1-6]

Y2HGold感受态细胞是GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为:trp1,leu2，报告基因为：AbAr,HIS3,ADE2,MEL1。

Y2HGold-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。

GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域（DNA-BD）和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。

BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白（bait-BD）和prey融合蛋白（prey-AD），如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。

Y2HGold有四个报告基因：AbAr,HIS3,ADE2,MEL1，分别由三种不同的启动子（G1，G2，M1）启动，这三种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。

应用^[7][8]

同种接合型酵母菌株Y2HGold的原生质体融合研究：

原生质体融合也称为体细胞杂交或细胞融合,是通过人工方法使具有不同遗传性状的两个细胞的原生质体发生融合,并产生单核或多核融合子的过程,是“细胞工程”的重要内容。原生质体融合技术分诱导融合和自发融合,前者是指分离原生质体后,通过加入诱导剂或使用其他方法诱导使不同亲本原生质体发生融合的过程；后者是指细胞或植物组织在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象。

体细胞杂交可在种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体间进行,它不仅可以突破物种间的生殖隔离,创造远缘杂种；同时还可以使双亲的细胞质基因结合在一起,从而达到改良更多性状的目的。

为避开有性融合的局限性,本文利用酵母原生质体无性融合的方法,研究同种接合型酵母菌株无性融合的条件及特点,首先利用质粒构建了酵母双杂交工程菌株Y2HGold的亮氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型菌株,接着采用酶解法进行四因素三水平正交实验获得原生质体制备方案,最后采用PEG诱导融合的方法,经过同样正交实验得到优化后的Y2HGold无性融合条件,筛选得到遗传上稳定的无性融合子。

研究结果总结如下：

遗传标记本实验根据酵母双杂交工程菌株Y2HGold基因结构特点,成功构建了亮氨酸、色氨酸缺陷型菌株。

融合影响因素单因素试验及正交实验结果表明,酶解温度、酶处理时间、酶浓度和预处理剂这四个与制备原生质体相关的关键因素对原生质体的制备和再生都有影响,其中酶解温度和酶处理时间对再生率和制备率的影响差异达到极显著水平(P<0.01),混合酶对原生质体再生率的影响差异达到显著水平,而预处理剂对原生质体再生率的影响差异不显著；无性融合四个主要因素对融合率的影响差异都具有极显著性意义。

原生质体的制备和融合方案Y2HGold原生质体制备方案：酶解温度30℃,处理时间80 min、预处理剂含0.1%(w/v)巯基乙醇和0.1%(w/v)EDTA-2Na,酶解液为1.5%(w/v)蜗牛酶和1.5%(w/v)纤维素酶；Y2HGold无性融合条件为：PEG浓度35%、温度25℃、时间40min、pH5.8,融合率达12.6×10-6。

无性融合与有性融合的区别从融合菌株的显微结构上看得到无性融合子“三叶草”结构图中的子细胞较有性融合子的子细胞普遍偏大、母细胞偏小,而有性融合子的子细胞与母细胞大小相当,这说明在融合子形态上表现为无性融合比有性融合可能更为彻底；在时间上无性融合可以在短短的40 min内融合,有性融合则需要20～24h,但在培养过程中无性融合子在SD/2培养基上生长缓慢、周期偏长,这说明aa和aa跟aa相比具有生长劣势

参考文献

[1]Development of rapeseed with high erucic acid content by asymmetric somatic hybridization between Brassica napus and Crambe abyssinica.Wang YP,Sonntag K,Rudloff E.Theoretical and Applied Genetics.2003

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[3]Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.Neumann E,Rosenheck K.Journal of Membrane Biology.1972

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[5]Electroporation of cell membrane.Song T Y.Biophysical Journal.1991

[6]Medical Applications of Electroporation.Dev S B,Rabussary D P,Georg Widera,et al.IEEE Transactions on Plasma Science.2000

[7]Intergeneric hybridization of trichoderma reesei QM9414 and saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion.Kumari J Anjani,Panda T.Enzyme and Microbial Technology.1994

[8]常登龙.同种接合型酵母菌株Y2HGold的原生质体融合研究[D].西南大学,2012.