人睾丸支持细胞的培养及传代

背景及概述^[1]

人睾丸支持细胞分离自睾丸；睾丸支持细胞又称Sertoli细胞，在体内呈不规则的高锥体形，细胞基部附着在基膜上，顶部伸至曲精小管腔面。它是生精细胞的支架，为其提供必需的营养物质，能合成与分泌雄激素结合蛋白，为其提供高浓度的雄激素环境等，还具有构成血-睾屏障，形成睾丸内微环境，调节精子发生等功能。人睾丸支持细胞是睾丸的主要组成细胞，能分泌多种生长因子和免疫抑制因子，不仅可为精子提供营养支持和免疫保护，也能对其他细胞，如胰岛和神经细胞提供营养支持，而且当其与胰岛或神经细胞共移植时，也能够为这些细胞提供免疫保护，提高植活率。因此，人睾丸支持细胞在细胞移植中具有广泛的应用前景。制备高活率的Sertoli不仅对Sertoli的基础研究有重要价值，而且在精子发生等领域有重要意义。

细胞分离^[1]

无菌环境下切取睾丸，置于Hanks液中剥除白膜，将睾丸组织机械剪碎后采用两步酶消法进行处理。以1mg/mL的胶原酶Ⅳ(Gibco公司)置37℃孵化15min，每5min摇动一次。再以0.25%的胰蛋白酶/1μMEDTA(Sigma公司)进行消化，10min后以含10%胎牛血清的DMEM终止消化。台盼蓝染色计数死细胞数目均在5%以下。40μm细胞滤网(BD公司)过滤去除杂质，在4℃下300g离心5min，用培养基重悬后接种到明胶预先处理过的培养皿进行培养。

培养及传代^[1]

培养基采用DMEM(Gibco公司)，1×非必需氨基酸、50μM2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠(均来自Gibco公司)，10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF，BD公司)，2.5ng/mL表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF，invitrogen公司)，100ng/mLβ-estradiol(sigma公司)。每日通过倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录，每4～5天传代一次。当皿内细胞接近80～90%融和时，胰酶消化培养细胞，按1∶2传代细胞接种于明胶预处理的培养皿中。原代培养细胞接种24h，倒置显微镜下观察到大部分细胞贴壁生长，细胞呈多角形有2～4个突起，形态不规则，贴壁牢固，数量占贴壁细胞的80%以上；少数贴壁细胞呈梭形，无突起，可能是间质细胞、成纤维细胞或管周肌样细胞。在贴壁细胞上层有贴附不牢固的圆形细胞，多为生精细胞。48h后更换培养液，吹打去除贴壁不牢的的生精细胞，可见支持细胞的胞体增大，呈荷叶状铺在培养瓶底，部分汇合成片，胞核清晰可见，胞质丰富。

主要参考资料

[1] 人睾丸支持细胞的分离培养及鉴定