Taq DNA聚合酶的应用

背景^[1-3]

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。其分子量为65kD，具有多种特性，包括：

1.热稳定性：这是Taq DNA聚合酶最显著的特点。即使在高温（如70℃、93℃和95℃）下反应数小时，它仍能保持较高的活性。这种特性使得它在PCR（聚合酶链式反应）过程中能够持续发挥作用，无需每轮循环时重新加入新酶。

2.聚合酶活性：Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，可以以DNA为模板，以结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以Watson—Crick配对的方式按5'→3'方向沿模板顺序合成新的DNA链。

3.核酸外切酶活性：除了聚合酶活性，Taq DNA聚合酶还具有5’→3'核酸外切酶活性，这种活性是依赖于DNA合成的链置换的。

4.转录活性：此外，Taq DNA聚合酶还具有转录活性。

较弱的非模板依赖性：这意味着它在某些情况下可以在没有模板的情况下进行DNA合成，但这种能力相对较弱。

5.缺乏3'→5'外切酶活性：与某些其他DNA聚合酶不同，Taq DNA聚合酶不具有3'→5'外切酶活性。

Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶在多个领域都有广泛的应用，包括基因检测和分析、药物研发、生物学研究以及生物工程和基因工程等。在PCR技术中，结合Taq酶的高灵敏性和特异性，它可用于早期疾病诊断。在基因检测和分析中，它用于扩增和分析特定基因或DNA序列，从而诊断遗传性疾病、进行基因表达研究、DNA指纹分析等。

Taq DNA聚合酶是一种非常常用的DNA聚合酶，具有耐高温、高保真性、快速和易于使用等优点，广泛应用于分子生物学研究和临床诊断等领域。

应用^[4][5]

Taq DNA聚合酶可以用于Taq DNA聚合酶的结构修饰与表征

根据Taq DNA聚合酶的结构与功能信息以及前人对该酶的研究,对Taq DNA聚合酶基因进行了结构修饰,并对修饰后的聚合酶活性进行了表征,旨在提高酶对抑制剂的耐受程度,使其既可以应用于普通PCR体系和实时荧光PCR体系中,也可以应用于全血和土壤提取物直接扩增的体系。

概述了PaqDNA聚合酶的发现、性质、结构及其在PCR技术中的应用。TaqDNA聚合酶应用广泛,但在临床应用中仍有诸多不足之处。通过对Taq DNA聚合酶进行结构改造或化学修饰,可以降低或消除酶的5’-3’核酸外切酶活性,提高酶的耐热性、续进性、忠实性、特异性、对抑制剂的耐受程度以及使酶具有热启动活性等。

利用基因工程技术对Taq DNA聚合酶进行改造。首先,通过定点突变对酶的3个氨基酸位点进行突变,即E626K、I707L和E708Q。其中E626K和1707L这两个位点的突变可以提高酶的最适反应温度,减少非特异性产物的扩增。E708Q的突变可以显著提高酶对多种PCR抑制剂的耐受能力。其次,通过缺失突变去除了酶N端的278个氨基酸,以消除酶的5’-3’核酸外切酶活性。在基因突变改造后,我们还对改造后的酶进行柠康酸酐修饰,以使其具有热启动的效果,从而减少PCR扩增中引物二聚体及非特异性产物的扩增。

对改造后的酶—KT-C3DNA聚合酶的性质进行表征。首先,考察该酶的热稳定性和最适反应温度。结果显示KT-C3DNA聚合酶具有较高的热稳定性,在95℃加热4h后还能进行正常的PCR扩增,它的最适延伸温度比普通Taq DNA聚合酶提高约4℃,较高的延伸温度可以有效减少引物二聚体及非特异性产物的扩增。其次,考察KT-C3DNA聚合酶在实时PCR体系中的应用性能,并与商品Taq DNA聚合酶及具有热启动活性的Taq-HS(Takara)作对比。发现该酶具有与商品酶相当的扩增效果和灵敏度。

考察KT-C3DNA聚合酶对乙醇、SDS、NaCl的耐受程度,及在全血和土壤提取物中的扩增性能,发现该酶可以耐受10%的乙醇、0.048%的SDS、100mM的NaCl。可以在35%及以上的全血中进行很好的扩增,而且在含有5%的全血中还能达到1×101copies/μL的扩增灵敏度,柠康酸酐修饰后的KT-C3DNA聚合酶还能耐受10μL/反应的土壤提取物,并且在含有4μL/反应的土壤提取物中还能达到1×100copies/μL的扩增灵敏度。说明KT-C3DNA聚合酶对抑制剂的耐受程度远远高于一般的商品酶。一定程度上降低了PCR反应对模板的要求,扩大了PCR技术的应用范围。对促进DNA聚合酶的发展和PCR技术在分子诊断技术上的应用都具有重要意义。

参考文献

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