RRBS甲基化测序步骤

背景及概述^[1-2]

甲基化就是人体内新陈代谢产生的“甲基分子集团”贴到了蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)和其他分子上。它是遗传基因调控生命活动的重要化学反应，参与胚胎发育、衰老、肿瘤发生等诸多生理、病理过程，是身体正常运转保持自然健康状态所必需的。DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点，与基因表达、表型性状息息相关，是基因调控的手段之一，通过对位于启动子及外显子区的CpG岛的甲基化而抑制基因的表达。在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面起着至关重要的作用。      

RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一种准确且高性价比的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中有着广泛的应用。RRBS通过限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛区域，再进行Bisulfite转化，用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱。

测序步骤^[2]

• 基因组DNA提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获取高质量的基因组DNA。

• DNA质量检测：Qubit检测DNA样品浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

• MspⅠ酶切：通过酶切富集CpG片段。

• 末端修复，加A，甲基化接头连接：在DNA分子两端引入接头序列及index序列。

• 选择CpG富集的DNA片段

• Bisulfite转化：通过Bisulfite作用将非甲基化碱基C转化成U。

• PCR富集：PCR扩增富集文库片段。

• 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布，Qubit 3.0或荧光定量PCR测定文库浓度。

• 上机测序：根据数据量要求将文库pooling上机测序。

• 数据分析：下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析，提供全面数据分析报告。

样品要求^[2]

• 样品类型：细胞、新鲜组织或DNA样品。

• 样品量：细胞样品请提供至少5×106个细胞，组织样品请提供至少2-3 g的组织块或切片，DNA样品请提供6 μg以上的总DNA。

• 样品质量：DNA无明显降解，无蛋白污染，OD260/280值≥1.5，OD260/230值≥1.0，浓度≥50  ng/μL，

• 样品保存：

 细胞样品：收集细胞至RNase Free 1.5 mL EP管，弃去培养基，用PBS洗一次，弃去PBS，把细胞沉淀保存在-80℃。

组织样品：组织样品离体后放在冻存管中，迅速置于液氮下速冻1分钟以上，然后保存在-80℃。

DNA样品：可将DNA溶于Nuclease Free 的超纯水中，-20℃保存。

样品保存期间避免反复冻融。

样品运输：样品置于1.5 mL管中，封口膜封好，冷冻运输。

参考文献

[1] 新编老年学词典

[2] RRBS甲基化测序技术说明书