SMMC7721 人肝癌细胞的应用

背景^[1-3]

SMMC7721人肝癌细胞是一种人肝癌细胞系，由中国第二军医大学病理解剖学教研室于1977年建立。该细胞株的细胞核质比较大，核形状不规则，常见畸形核，核内常见多个核仁，细胞表面微绒毛丰富，细胞边缘丝状伪足较多，片状伪足较少，核内异染色质团块较多，线粒体分布不均匀，线粒体嵴不发达，高尔基体囊泡排列不规则，内质网较不发达。

在细胞培养中，SMMC7721人肝癌细胞通常使用含10%小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，并在37℃含5%CO2、95%空气的恒定湿度细胞培养箱内进行传代培养。

SMMC7721人肝癌细胞被广泛用于肝癌的实验研究和药物筛选。然而，值得注意的是，有报道称SMMC-7721细胞株在某些实验中被发现存在HeLa细胞的污染。因此，在使用该细胞株时需要格外小心，并确认细胞的纯度。

SMMC7721人肝癌细胞

SMMC7721人肝癌细胞培养操作

1)复苏SMMC7721人肝癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)SMMC7721人肝癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)SMMC7721人肝癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

SMMC7721人肝癌细胞可以用于microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究

研究ryr3基因microrna结合位点单核苷酸多态性对SMMC7721人肝癌细胞细胞功能的影响目的:本部分应用SMMC7721人肝癌细胞作为研究对象,采用小干扰rna技术沉默ryr3在肝细胞癌smmc-7721细胞中的表达,观察转染ryr3sirna后肝细胞癌smmc-7721细胞增殖与凋亡的变化,了解位于ryr3基因mirna结合位点rs1044129对肝癌细胞功能的影响,以此证实其对hcc患者预后的影响。

方法:1)以psi-u6为载体构建ryr3敲低质粒,合成4对候选ryr3-shrna和1对阴性对照nc-shrna。制备感受态大肠埃希菌,并进行质粒转化及提取,应用质粒和lipofectamine2000混合液转染SMMC7721人肝癌细胞细胞,经过培养后倒置显微镜下观察到培养的肝癌细胞出现绿色荧光,证明细胞转染成功。将实验细胞分为3组,正常对照组(blank-control),阴性对照转染组(control-sirna/lipofactamine2000)和实验组(ryr3-sirna/lipofactamine2000)。

2) westernblot方法筛选出ryr3沉默最佳的SMMC7721人肝癌细胞细胞进行后续的实验。

3) mts法检测转染ryr3基因后对SMMC7721人肝癌细胞细胞增殖的影响。

4) 应用流式细胞仪检测转染ryr3基因后对SMMC7721人肝癌细胞细胞凋亡的影响。

5) 统计学方法:评估blank-control和control-sirna与ryr3转染组的差异采用两独立样本t检验,所有数据分析均使用spss18.0统计软件包处理,p<0.05被认为有统计学意义。

结果:1)质粒转染SMMC7721人肝癌细胞细胞后,培养48h后通过倒置荧光显微镜在激发波长480nm条件下检测转染细胞,镜下可见肝癌细胞表达gfp绿色荧光,转染效率达到91%。

2) 应用westernblot检测SMMC7721人肝癌细胞结果显示:转染48h后,sirna-1,sirna-2,sirna-3和sirna-4均有效降低SMMC7721人肝癌细胞内源ryr3蛋白的表达水平,与对照组相比分别降低了48.6%、54.7%、36.9%和38.2%。因此,选取沉默最佳的sirna-2用于后续的细胞功能实验。

3) 应用mts法检测SMMC7721人肝癌细胞细胞转染RYR3-siRNA基因后0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,72 h的吸光值(OD)。mts法检测研究结果显示,RYR3-siRNA组的OD值分别为0.867±0.010、1.184±0.059、1.441±0.082、1.659±0.102、1.744±0.065、1.862±0.033、1.998±0.093;Control-siRNA组分别为0.868±0.080、1.327±0.052、1.837±0.076、2.220±0.138、2.449±0.072、2.535±0.035、2.613±0.176;Blank-control组0.863±0.107、1.568±0.131、1.919±0.059、2.554±0.082、2.715±0.078、2.804±0.112、2.986±0.086。在各观察时段SMMC7721人肝癌细胞生长均出现不同程度的抑制,且抑制率随转染后培养时间的延长而增加,各时间段比较有显著性差异,且与Control-siRNA组和Blank-control组也有显著性差异(P<0.05)。

4) 转染RYR3对SMMC7721人肝癌细胞细胞凋亡的影响:通过流式细胞仪检测转染后肝癌细胞凋亡率可见,转染后肝癌细胞RYR3-siRNA组凋亡率为39.010±1.677,Control-siRNA组为12.379±1.075,Blank-control组为5.373±0.456,RYR3-siRNA组凋亡率与其余2组凋亡率相比明显下降,结果均有显著性差异(P<0.05)。

RYR3(rs1044129)沉默可抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖并诱导其细胞凋亡。

参考文献

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[5]彭晨星.microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究[D].河北医科大学,2016.