NCI-H196人肺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H196人肺癌贴壁细胞系是一种人小细胞肺癌细胞系，建于1979年10月，患者之前接受过化疗和放疗，组织捐献者不吸烟。该细胞系的生长特性为贴壁细胞，形态上皮细胞样。

NCI-H196人肺癌贴壁细胞系

一．NCI-H196人肺癌贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备

1）准备1640基础培养基(iCell-0002)89%；优质胎牛血清（iCell-0500）10%；P/S青霉素-链霉素（iCell-15140-122）1%；

2)NCI-H196人肺癌贴壁细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．NCI-H196人肺癌贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）NCI-H196人肺癌贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4-5]

NCI-H196人肺癌贴壁细胞系可以用于DNAH10突变在小细胞肺癌原发化疗耐药中的作用及机制探讨

利用数据库信息分析了来自癌症药物敏感性基因组学小细胞肺癌细胞系(GDSC,N=55)的全外显子测序(WES)数据集和已发表研究的小细胞肺癌的队列(N=101)的WES数据和整体生存率(OS),以寻找顺铂耐药性靶基因和与不良预后相关的基因。

结果发现SCLC中的DNAH10突变与原发顺铂耐药性相关(P=0.0350),OS差(HR:3.445;P=0.00035)和较差的无进展生存期(PFS)显著相关(P=0.0142)。随即应用生物信息学分析单样本基因集富集分析(ssGSEA)探索顺铂耐药的潜在信号通路。ssGSEA显示,DNAH10突变与FGFR和FGF的SPRY调控呈负相关关系,与非经典性WNT和AKT/IKK信号通路成正相关关系,并与肿瘤突变负荷(TMB)成正相关。

第二部分,选择多株小细胞肺癌细胞系(分别为DNAH10突变细胞H2066和野生型细胞H69,H446，NCI-H196人肺癌贴壁细胞系等),通过RT-PCR、Western blot及CCK8等功能实验,发现与DNAH10野生型细胞相比较,DANH10突变细胞中DANH10的mRNA水平及蛋白表达水平均明显升高,进一步通过药物敏感性实验,发现突变型细胞H2066的耐药性明显高于其它DANH10野生型细胞(H69,H446);当使用siRNA敲低H2066细胞中DANH10的表达后,发现敲低DNAH10的H2066细胞的IC50值降低。

第三部分,收集47例小细胞肺癌患者的临床组织样本,行免疫组化发现DNAH10蛋白表达于肿瘤细胞胞浆,而且与DNAH10未突变患者相比较,在突变患者的肿瘤组织中表达增高;同时根据47例患者的临床资料,证实发生突变的患者生存期低于未突变患者,结果具有统计学意义。

综上所述,DNAH10突变可能具有预测小细胞肺癌原发化疗耐药性和不良生存的潜在价值。

参考文献

[1]Genomic and Functional Fidelity of Small Cell Lung Cancer Patient-Derived Xenografts.Benjamin J.Drapkin;;Julie George;;Camilla L.Christensen;;Mari Mino-Kenudson;;Ruben Dries;;Tilak Sundaresan;;Sarah Phat;;David T.Myers;;Jun Zhong;;Peter Igo;;Mehlika H.Hazar-Rethinam;;Joseph A.Licausi;;Maria Gomez-Caraballo;;Marina Kem;;Kandarp N.Jani;;Roxana Azimi;;Nima Abedpour;;Roopika Menon;;Sotirios Lakis;;Rebecca S.Heist;;Reinhard Buttner;;Stefan Haas;;Lecia V.Sequist;;Alice T.Shaw;;Kwok-Kin Wong;;Aaron N.Hata;;Mehmet Toner;;Shyamala Maheswaran;;Daniel A.Haber;;Martin Peifer;;Nicholas Dyson.Cancer Discovery,2018

[2]Microsatellite instability status determined by next‐generation sequencing and compared with PD‐L1 and tumor mutational burden in 11,348 patients.Ari Vanderwalde;;David Spetzler;;Nianqing Xiao;;Zoran Gatalica;;John Marshall.Cancer Medicine,2018

[3]Molecular genetics and targeted therapy of WNT-related human diseases(Review).Masuko Katoh;;Masaru Katoh.International Journal of Molecular Medicine,2017

[4]Evolution of Neoantigen Landscape during Immune Checkpoint Blockade in Non–Small Cell Lung Cancer.Valsamo Anagnostou;;Kellie N.Smith;;Patrick M.Forde;;Noushin Niknafs;;Rohit Bhattacharya;;James White;;Theresa Zhang;;Vilmos Adleff;;Jillian Phallen;;Neha Wali;;Carolyn Hruban;;Violeta B.Guthrie;;Kristen Rodgers;;Jarushka Naidoo;;Hyunseok Kang;;William Sharfman;;Christos Georgiades;;Franco Verde;;Peter Illei;;Qing Kay Li;;Edward Gabrielson;;Malcolm V.Brock;;Cynthia A.Zahnow;;Stephen B.Baylin;;Robert B.Scharpf;;Julie R.Brahmer;;Rachel Karchin;;Drew M.Pardoll;;Victor E.Velculescu.Cancer Discovery,2017

[5]李曼.DNAH10突变在小细胞肺癌原发化疗耐药中的作用及机制探讨[D].南方医科大学,2021.