C8-D1A的应用

背景^[1-3]

C8-D1A源自出生8天小鼠小脑组织，由B Pessac,D Trisler建立。该细胞具有小神经胶质细胞特征。该细胞为GFAP阳性细胞，除此之外，没有检测到其它神经胶质神经元或小神经胶质细胞的分子标记。C8-D1A细胞具有类似于原代星形胶质细胞的形态和生理特征，可以用于研究星形胶质细胞的生长、分化及功能。

C8-D1A

C8-D1A小鼠小脑组织细胞培养操作

1）复苏C8-D1A细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）C8-D1A细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）C8-D1A细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

C8-D1A可以用于海人酸（KA）诱导星形胶质细胞NLRC4炎症小体活化及ε-viniferin的干预研究

通过KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,分析NLRC4炎症小体活化在KA诱导后的星形胶质细胞相关神经炎症中的作用及ε-viniferin的干预效应,为发现癫痫形成过程中星形胶质细胞神经炎症的关键分子及其干预策略提供理论和实验依据。

研究方法1、分析KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:(1)KA作用浓度与时间筛选:用不同浓度的KA(10μm、25μm、50μm、100μm)诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h(KA-50μm组增加48h作用时间点),对照组加入等量的完全培养基培养24h与48h通过CCK8检测各组细胞存活率;通过ELISA检测不同KA作用浓度及时间点下各组细胞IL-1β的分泌量;

(2) 采用50μm KA或完全培养基诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h后,通过Western blotting检测细胞中标记物胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、NLRC4、Caspase-1/P20/P10和Cleaved-IL-1β蛋白的表达。

2、分析沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4、Caspase-1、IL-1β表达的影响:

(1) 向小鼠星形胶质细胞株C8-D1A转染沉默NLRC4基因的短发卡RNA(NLRC4 shRNA)慢病毒载体(sh-NLRC4组)或作为阴性对照的Vehicle shRNA慢病毒空载体(sh-CON组),通过荧光显微镜观察NLRC4 shRNA慢病毒是否成功感染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A;通过RT-qPCR及Western blotting检测NLRC4 shRNA慢病毒对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内NLRC4表达的抑制效应;

(2) 应用NLRC4 shRNA慢病毒或Vehicle shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A,加用50μm KA诱导48h,分为四组;sh-CON组、sh-CON+KA-50μm组、sh-NLRC4组、sh-NLRC4+KA-50μm组。分别通过Western blotting及ELISA法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β蛋白的表达及IL-1β的分泌。

3、分析ε-viniferin对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及Caspase-1、IL-1β表达的影响:(1)应用1μmε-viniferin作用小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 24h,分为三组:control组、溶剂对照DMSO组、vinifelin组。通过CCK8检测各组细胞存活率;(2)应用50μm KA诱导小鼠星形胶质细胞株C8-D1A 48h,加用1μmε-viniferin预处理24h,分为四组:control组、KA组、vinifelin+KA组、vinifelin组。分别通过Western blotting及ELISA法检测各组细胞中NLRC4及Caspase-1/P20/P10、Cleaved-IL-1β蛋白的表达及IL-1β的分泌。

结果1、KA对小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4炎症小体活化及下游信号蛋白Caspase-1和炎症因子IL-1β表达的影响:(1)KA作用浓度与时间筛选:小鼠星形胶质细胞株C8-D1A经不同浓度KA诱导24h后,KA-10μm组、KA-25μm组、KA-50μm组细胞存活率均较KA-0μm组显著增高(P<0.05),且以KA-10μm组、KA-25μm组更为明显(P<0.01),而KA-100μm组细胞存活率较KA-0μm组显著下降(P<0.01);KA-50μm组、KA-100μm组培养液中IL-1β分泌量较KA-0μm组显著增高(P<0.01),且KA-50μm-48h组条件性培养液中IL-1β分泌量较KA-0μm-48h组及KA-50μm-24h均存在显著增高(P<0.01);(2)Western blotting结果显示,与对照组相比,KA-50μm组细胞内GFAP蛋白表达较明显升高(P<0.05);与对照组相比,KA-50μm组NLRC4、下游信号蛋白Caspase-1活性体Caspase-1/P20/P10、炎症因子IL-1β剪切体Cleaved-IL-1β蛋白表达均明显升高(P<0.01)。

2、沉默NLRC4的表达对KA诱导的小鼠星形胶质细胞株C8-D1A中NLRC4及Caspase-1、IL-1β表达的影响:(1)NLRC4 shRNA慢病毒转染小鼠星形胶质细胞株C8-D1A后15d,嘌呤霉素1μg/ml筛选7d后,可在荧光显微镜下观察到,与明场下细胞形态对比,小鼠星形胶质细胞株C8-D1A内存在明显绿色荧光分布;RT-qPCR结果显示,sh-NLRC4组NLRC4 mRNA相对表达量较sh-CON组下降88.12%,差异具有统计学意义(P<0.01);Western blotting结果显示,sh-NLRC4组NLRC4蛋白的表达水平较sh-CON组显著降低(P<0.05)。

参考文献

[1]Cross Kingdom Immunity:The Role of Immune Receptors and Downstream Signaling in Animal and Plant Cell Death.Roudaire Thibault;Héloir Marie Claire;Wendehenne David;Zadoroznyj Aymeric;Dubrez Laurence;Poinssot Benoit.Frontiers in Immunology,2021

[2]Prolactin treatment reduces kainic acid-induced gliosis in the hippocampus of ovariectomized female rats.Julio Reyes-Mendoza;;Teresa Morales.Brain Research,2020

[3]The role of inflammation in epileptogenesis.Fanwei Meng;;Lifen Yao.Acta Epileptologica,2020

[4]NLRC4 biology in immunity and inflammation..Andrade Warrison A;;Zamboni Dario S.Journal of leukocyte biology,2020

[5]李倩.海人酸（KA）诱导星形胶质细胞NLRC4炎症小体活化及ε-viniferin的干预研究[D].苏州大学,2023.