SNU-387人肝癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

SNU-387人肝癌贴壁细胞系于1990年由J.-G.Park及其同事取自一名韩国患者的原发性肝细胞癌，该患者接受了脂质体加阿霉素和丝裂霉素C联合经导管动脉栓塞治疗，肿瘤组织最初在补充有5%热灭活胎牛血清的ACL-4培养基中培养，细胞系建立后后将细胞保持在补充有10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640中。原来的肿瘤大致是单个结节，组织学上，主要为致密型和小梁型，培养的细胞含有单个细胞核。SNU-387细胞用Southern杂交检测到乙型肝炎病毒（HBV）DNA，HBV基因组RNA未表达。SNU-387细胞可以用于3D细胞培养、癌症研究、传染病研究、性传播疾病研究。

SNU-387人肝癌贴壁细胞系

SNU-387人肝癌贴壁细胞系细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；NEAA，1%；双抗，1%。

2）SNU-387人肝癌贴壁细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）SNU-387人肝癌贴壁细胞系冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．SNU-387人肝癌贴壁细胞系细胞处理：

1）复苏SNU-387人肝癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）SNU-387人肝癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

SNU-387人肝癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

SNU-387人肝癌贴壁细胞系可以用于LncRNA-HOTAIR对肝癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡的机制研究

通过探讨LncRNA-HOTAIR对肝癌细胞增殖,侵袭转移和凋亡生物学行为的影响,阐明LncRNA-HOTAIR参与调控的生物学行为对肝癌进展的重要性,为寻找肝癌的临床生物学标志物做初步探索。

实验方法:1.q-PCR检测不同类型肝癌细胞中HOTAIR的基础表达量,选择理想的实验细胞株。

2. 实时无标记动态细胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)生长状态的影响;克隆形成实验检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)增殖能力的影响。

3. Transwell(Matrigel-)以及划痕实验分别检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)垂直方向和水平方向迁移能力的影响;Transwell(Matrigel+)检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)侵袭能力的影响。

4. Western blot和q-PCR分别检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)侵袭转移和凋亡相关通路的分子在蛋白水平和转录水平的变化。

5. 细胞免疫荧光技术以及细胞核/浆蛋白分离试剂盒检测HOTAIR对上皮间质转化过程中转录因子Snail2核内表达量的影响。免疫荧光Hoechst染色检测HOTAIR对肝癌细胞凋亡发生过程中细胞(Hep G2,SNU-387)核形态的变化。

6.流式细胞术检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)凋亡和线粒体膜电势变化的影响。

7.TCGA数据库分析HOTAIR和E-cadherin(CDH1)以及HOTAIR和Snail2在m RNA转录水平的相关性。

实验结果:1.与肝正常细胞(changliver)相比,五种肝癌细胞系中,Hep G2细胞中HOTAIR的基础表达量最高(4.2倍),其次是SNU-387(3.5倍)。

2. 过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞的增殖速率较CON组加快,细胞倍增时间缩短。sh-HOTAIR组中Hep G2,SNU-387细胞的增殖速率较sh-NC组减慢,倍增时间延长;此外,过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞克隆能力较CON组增强;sh-HOTAIR组Hep G2,SNU-387细胞的克隆能力较sh-NC组减弱。

3.过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞的侵袭迁移能力较CON组增强;sh-HOTAIR组Hep G2,SNU-387细胞的侵袭迁移能力较sh-NC组减弱。

4.与CON组相比,过表达HOTAIR后,SNU-387细胞中MMP2和MMP9在蛋白和m RNA转录水平均明显上升;上皮细胞标志物E-cadherin的表达量在蛋白和m RNA转录水平均明显降低;间质标志物N-cadherin在蛋白水平明显上调,m RNA转录水平无明显变化;Snail2在蛋白和m RNA转录水平均明显上升。与sh-NC组相比,sh-HOTAIR组Hep G2和SNU-387细胞中,MMP2和MMP9在蛋白和m RNA转录水平均显著降低;Hep G2细胞sh-HOTAIR组中E-cadherin在蛋白和m RNA转录水平明显上升;N-cadherin仅在蛋白水平明显降低,转录水平无明显变化;Snail2在蛋白和m RNA转录水平明显降低。SNU-387细胞sh-HOTAIR组中E-cadherin在蛋白和m RNA转录水平均明显上升;N-cadherin和Snail2在蛋白水平明显降低,转录水平均无明显变化;与Con组相比,SNU-387细胞过表达HOTAIR组中Snail2核内表达量增加,荧光强度增强。与sh-NC组相比,Hep G2和SNU-387细胞sh-HOTAIR组中Snail2核内表达量减少,荧光强度减弱。

参考文献

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[2]LncRNA HOTAIR epigenetically suppresses miR-122 expression in hepatocellular carcinoma via DNA methylation.Di Cheng;;Junge Deng;;Bin Zhang;;Xiaoyu He;;Zhe Meng;;Guolin Li;;Huilin Ye;;Shangyou Zheng;;Lusheng Wei;;Xiaogeng Deng;;Rufu Chen;;Jiajia Zhou.EBioMedicine,2018

[3]Sustained proliferation in cancer:Mechanisms and novel therapeutic targets.Mark A.Feitelson;;Alla Arzumanyan;;Rob J.Kulathinal;;Stacy W.Blain;;Randall F.Holcombe;;Jamal Mahajna;;Maria Marino;;Maria L.Martinez-Chantar;;Roman Nawroth;;Isidro Sanchez-Garcia;;Dipali Sharma;;Neeraj K.Saxena;;Neetu Singh;;Panagiotis J.Vlachostergios;;Shanchun Guo;;Kanya Honoki;;Hiromasa Fujii;;Alexandros G.Georgakilas;;Alan Bilsland;;Amedeo Amedei;;Elena Niccolai;;Amr Amin;;S.Salman Ashraf;;Chandra S.Boosani;;Gunjan Guha;;Maria Rosa Ciriolo;;Katia Aquilano;;Sophie Chen;;Sulma I.Mohammed;;Asfa.Seminars in Cancer Biology,2015

[4]The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration.Samir Ounzain;;Thierry Pedrazzini.Trends in Cardiovascular Medicine,2015

[5]郑心子.LncRNA-HOTAIR对肝癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡的机制研究[D].吉林大学,2020.