AML12的应用

背景^[1-3]

AML12小鼠正常肝细胞，是从携带人TGF-α基因的转基因小鼠（CD1株，MT42系）的肝细胞中构建的，属于原代永生化细胞，可用于研究肝脏疾病的发生发展。

AML12，贴壁生长，上皮细胞样，呈多角形，直径约为20-30um，电镜下表现出典型的肝细胞特征，如过氧化物酶体和胆管状结构。AML12(小鼠肝12)细胞系是从携带人TGF-alpha基因的转基因小鼠(CD1株，MT42系)的肝细胞中构建的。AML12细胞保留了表达血清(白蛋白、α-1抗胰蛋白酶和转铁蛋白)和缝隙连接(连接蛋白26和32)的高水平mRNA的能力，并且只包含乳酸脱氢酶的同工酶5。

AML12

AML12小鼠正常肝细胞培养步骤：

1）复苏AML12细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）AML12细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于AML12细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗AML12细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打AML12细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将AML12细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

AML12可以用于草甘膦对小鼠肝脏生物钟和糖脂代谢的影响

从生物钟的角度出发,通过在小鼠AML12肝细胞和ICR品系野生型雄性小鼠上建立草甘膦暴露模型,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)、过碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff,PAS)染色、试剂盒定量检测等多种实验技术,对草甘膦影响小鼠肝脏糖脂代谢的作用机制进行了探究,研究结果如下:

1. 通过CCK-8试剂盒和流式细胞术筛选出对AML12细胞的活力和凋亡都没有显著影响的草甘膦处理浓度(0.1 m M),并用此浓度对毛喉素同步化后的AML12细胞进行处理,使用q PCR和WB技术检测草甘膦对AML12细胞生物钟基因和糖脂代谢相关基因表达量与表达节律性的影响。结果表明,对照组和草甘膦处理组AML12细胞生物钟基因(Bmal1、Nr1d1与Dbp)m RNA的表达均具有节律性变化。0.1 m M的草甘膦显著抑制了AML12细胞生物钟基因(Bmal1、Nr1d1和Dbp)m RNA的表达,并降低了NR1D1蛋白的表达量。同时,0.1 m M的草甘膦显著抑制了Fasn、Pparα、Hmgcr与Glut2等糖脂代谢相关基因m RNA在AML12细胞的表达。

2. 为了探究草甘膦对小鼠生物钟系统与糖脂代谢的影响,通过查阅文献,最终确定以小鼠自由饮用0.5%草甘膦水溶液8周的方式进行造模,对照组小鼠自由饮用不含草甘膦的蒸馏水。造模期间,准确监测小鼠的行为活动节律、体重、采食量和饮水量。造模成功后,收集小鼠血液与肝脏组织样品,通过糖耐量试验、胰岛素耐量试验、PAS染色、q PCR、WB以及试剂盒等多种技术检测草甘膦对小鼠肝脏生物钟系统与糖脂代谢的影响。结果显示,与对照组相比,草甘膦处理组小鼠造模期间在光照条件下的活动量显著升高,采食量没有显著性差异,但饮水量显著下降;体重增长虽然与对照组相比差异不显著,但呈下降趋势。糖耐量试验结果表明,草甘膦处理组小鼠对葡萄糖的吸收和代谢速度显著低于对照组小鼠。

3. 胰岛素耐量试验结果表明,草甘膦处理组小鼠胰岛素敏感性和升血糖能力显著低于对照组小鼠。PAS染色和试剂盒定性定量检测结果表明,草甘膦处理组小鼠肝糖原含量显著低于对照组小鼠。胆固醇检测试剂盒定量检测结果说明,草甘膦处理组小鼠肝脏胆固醇含量显著低于对照组小鼠。q PCR和WB结果说明,对照组和草甘膦处理组小鼠肝脏生物钟基因(Bmal1、Nr1d1和Dbp)m RNA的表达均具有节律性,与对照组相比,草甘膦处理组小鼠生物钟基因m RNA的表达相位均发生了不同程度的延迟,但生物钟基因m RNA总体表达量无显著性差异。

此外,草甘膦处理组小鼠肝脏BAML1蛋白相较于对照组有下降趋势,但差异不显著,NR1D1蛋白总体表达量与对照组相比无显著性差异。与对照组相比,草甘膦处理组小鼠肝脏糖代谢相关基因(Glut2、Cd36与Pdk4)m RNA的总体表达量显著下降,同时肝脏脂质合成相关基因(Srebp-1c与Fasn)m RNA的表达量在ZT20(授时时间,Zeitgeber Time,ZT)时间点显著高于对照组,Pparγ基因m RNA表达量在ZT4时间点显著低于对照组,脂质分解相关基因Pparα的m RNA表达量在ZT20时间点显著高于对照组。

上述研究证据表明,草甘膦暴露抑制了AML12细胞部分生物钟基因和糖脂代谢相关基因的表达,扰乱了小鼠的活动节律,使小鼠肝脏生物钟基因m RNA表达相位延迟,降低了小鼠肝脏糖原与胆固醇的累积,造成小鼠糖脂代谢紊乱。然而,本研究仍存在一定的局限性,当前的结果无法证明肝脏生物钟系统参与了草甘膦对肝脏糖脂代谢功能的影响,并且尚缺乏对草甘膦影响肝脏糖脂代谢作用机制的深入解析。

参考文献

[1]Oxidative Stress and Metabolism:A Mechanistic Insight for Glyphosate Toxicology.[J].Wang Xiaojing;Lu Qirong;Guo Jingchao;Ares Irma;Martínez Marta;MartínezLarra?aga MaríaRosa;Wang Xu;Anadón Arturo;Martínez MaríaAránzazu.Annual review of pharmacology and toxicology,2022

[2]Comparative toxicogenomics of glyphosate and Roundup herbicides by mammalian stem cell-based genotoxicity assays and molecular profiling in Sprague-Dawley rats.[J].Mesnage Robin;Ibragim Mariam;Mandrioli Daniele;Falcioni Laura;Tibaldi Eva;Belpoggi Fiorella;Brandsma Inger;Bourne Emma;Savage Emanuel;Mein Charles A;Antoniou Michael N.Toxicological sciences:an official journal of the Society of Toxicology,2021(1)

[3]Parental Pesticide Exposure and Childhood Brain Cancer:A Systematic Review and Meta-Analysis Confirming the IARC/WHO Monographs on Some Organophosphate Insecticides and Herbicides[J].Feulefack Joseph;Khan Aiza;Forastiere Francesco;Sergi Consolato M..Children,2021(12)

[4]Pleiotropic Outcomes of Glyphosate Exposure:From Organ Damage to Effects on Inflammation,Cancer,Reproduction and Development[J].Marino Marianna;Mele Elena;Viggiano Andrea;Nori Stefania Lucia;Meccariello Rosaria;Santoro Antonietta.International Journal of Molecular Sciences,2021(22)

[5]江海圳.草甘膦对小鼠肝脏生物钟和糖脂代谢的影响[D].西北农林科技大学,2022.