人高转移潜能肝癌细胞的处理与培养

简介^[1-3]

人高转移潜能肝癌细胞；MHCC97-H是由上海医科大学中山医院建立,将一名我国39岁男性HCC患者的肝右叶转移病灶的手术切除标本接种于裸鼠肝内建造出人肝癌裸鼠转移模型(LCI-D20)而得。已证实,经过再次分离得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33种细胞株，依据它们的转移特点，虽来源同一父系，但具有异质性，即具有不同的转移潜能。

MHCC97人肝癌细胞系于1998年从裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)体外传代培养获得，该细胞系符合一般人恶性肿瘤的病理学和遗传学特征，细胞呈上皮样，贴壁生长，血清HBsAg、AFP高表达，成瘤率高且优先转移的靶器官是肺，肺转移率100%，故证实该细胞系为高转移特性的人肝癌细胞系。

2001年，研究者从MHCC97细胞系中发现并分离出不同转移潜能的2个细胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺转移率100%，后者40%；从生长速度上，前者细胞倍增时间较后者短；穿透人工基底膜能力前者较后者大；前者均较后者活力强、代谢旺。传代至20代后，两种形态学特征及生长速度方面均较稳定。之后又从MHCC97-H裸鼠接种后成功得到更高转移潜能的HCCLM3细胞系。

人高转移潜能肝癌细胞；MHCC97-H

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理

1）冻存细胞的复苏：：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

参考文献

[1]Cellular signaling for activation of Rho GTPase Cdc42[J].Soniya Sinha;;Wannian Yang.Cellular Signalling,2008(11)

[2]Adjuvant Intraportal Venous Chemotherapy for Patients with Hepatocellular Carcinoma and Portal Vein Tumor Thrombi Following Hepatectomy Plus Portal Thrombectomy[J].Li-Jian Liang;;Wen-Jie Hu;;Xiao-Yu Yin;;Qi Zhou;;Bao-Gang Peng;;Dong-Ming Li;;Ming-De Lu.World Journal of Surgery,2008(4)

[3]p51/p63,a novel p53 homologue,potentiates p53 activity and is a human cancer gene therapy candidate.[J].Kunisaki Reiko;;Ikawa Shuntaro;;Maeda Toyoki;;Nakazaki Yukoh;;Kurita Ryo;;Harata Masamitsu;;Shutoh Yukinobu;;Bai Yuang Sung;;Soda Yasushi;;Tanabe Tsuyoshi;;Dohi Taeko;;Kato Rie;;Ikawa Yoji;;Asano Shigetaka;;Tani Kenzaburo.The journal of gene medicine,2006(9）