小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的含量。

原理：本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠MIF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的MIF与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠MIF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，MIF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中MIF浓度。

小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)ELISA试剂盒

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清测定前用标本稀释液至少作1：5稀释（取4 0ul，加标本稀释液16 0ul,稀释5倍）。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成10 0ng/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入10 0ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品100 00、50 00、250 0、1250、625、312、156、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应MIF含量，再乘上稀释倍数即可。

应用^[4][5]

用于巨噬细胞移动抑制因子在围植入期小鼠子宫内膜中的表达及其作用的研究

目的①研究巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）在围植入期小鼠子宫内膜中的表达;②研究MIF拓扑酶抑制剂ISO-1（（S,R）-3-（4-hydroxyphenyl）-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid methyl ester,ISO-1）对胚胎植入和发育的影响;③研究应用ISO-1处理小鼠后,子宫内膜形态学改变及MIF表达的变化。

方法：以成年未经产雌性昆明种小鼠为研究对象,雌雄鼠3:1合笼,第二天清晨查到阴栓记作妊娠1d。分别将妊娠1～8d的120只小鼠颈椎脱臼处死,剖腹取其子宫并取动情期非妊娠小鼠子宫作对照,4%多聚甲醛固定,免疫组化SP法检测MIF蛋白的表达,原位杂交检测MIF mRNA的表达,显微成像系统拍摄图像并进行计算机图像分析。另将120只妊娠3d小鼠随机分4组,即低剂量组、中剂量组、高剂量组、1%二甲基亚砜（dimethy sulphoxide,DMSO）对照组。每组30只,低剂量、中剂量、高剂量组分别按2 mg/kg,6 mg/kg,18 mg/kg剂量一次性腹腔注射ISO-1,对照组注射等量1%DMSO;妊娠4d,每组各取15只妊娠小鼠,颈椎脱臼处死,取出子宫,4%多聚甲醛固定,HE染色、免疫组化SP法检测MIF蛋白的表达,原位杂交检测MIF mRNA的表达,显微成像系统拍摄图像并进行计算机图像分析;妊娠8d,处死另半数妊娠小鼠检测胚胎着床数和子宫脏器系数。

结果①免疫组化SP法和原位杂交染色显示:MIF蛋白的表达与mRNA表达一致。各组小鼠子宫内膜均可以检测到MIF的表达,主要表达于腺上皮、腔上皮及基质中的细胞团。对照组MIF呈较强表达;与对照组相比,妊娠1～3d子宫内膜MIF呈强表达,妊娠4～5d表达较弱,均主要表达于子宫内膜的腔上皮和腺上皮;而妊娠6～8d,MIF表达再次逐渐增强,并且随着胚胎植入后子宫内膜腺体的逐渐减少和宫腔的逐渐愈合,除了腺上皮和腔上皮强表达外,MIF主要表达于基蜕膜和次级蜕膜区,但初级蜕膜区MIF表达呈阴性。另外发现植入后的胚胎MIF也呈强表达。图像分析显示:妊娠1～3d及妊娠6～8d共计6组小鼠子宫内膜阳性细胞的平均光密度值（mean optical density,MOD）与动情期非妊娠小鼠相比差异均无显著性（P＞0.05）,6组之间差异也无显著性（P＞0.05）;妊娠4～5d两组小鼠子宫内膜阳性细胞的MOD值与动情期非妊娠小鼠、妊娠1～3d及妊娠6～8d 7组相比差异均有显著性（P＜0.05）,而两组之间差异无显著性（P＞0.05）。

②ISO-1对小鼠植入胚胎数和子宫脏器系数的影响:1%DMSO对照组妊娠小鼠植入胚胎数为10.27±1.71,子宫脏器系数为（1.037±0.201）%;低剂量组妊娠小鼠植入胚胎数为10.33±1.80,子宫脏器系数为（1.040±0.235）%,与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）;中剂量组妊娠小鼠植入胚胎数为10.93±2.09,子宫脏器系数为（1.119±0.244）%,与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;高剂量组妊娠小鼠植入胚胎数为12.40±2.16,子宫脏器系数为（1.094±0.190）%,与对照组相比植入胚胎数显著提高（P＜0.05）,而子宫脏器系数差异不显著（P＞0.05）。

③ISO-1对小鼠子宫内膜结构及MIF表达的影响:光镜观察未发现各组妊娠小鼠子宫内膜结构的明显差异;免疫组化SP法及原位杂交染色显示,MIF蛋白和mRNA在各组小鼠子宫内膜的腺上皮细胞与腔上皮细胞中均有阳性表达,但高、中、低剂量组阳性细胞的MOD值与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

参考文献

[1]Neutralization of macrophage migration inhibitory factor—novel approach for the treatment of immunoinflammatory disorders[J].Ivana Cvetkovic,Stanislava Stosic-Grujicic.International Immunopharmacology.2006(10)

[2]Effects of E-cadherin on mouse embryo implantation and expression of matrix metalloproteinase-2 and-9[J].Guoyi Liu,Xuan Zhang,Haiyan Lin,Hongmei Wang,Qinglei Li,Jiang Ni,Cheng Zhu.Biochemical and Biophysical Research Communications.2006(3)

[3]The role of macrophage migration inhibitory factor in the inflammatory immune response and rheumatoid arthritis[J].Leilani L.Santos,Eric F.Morand.Wiener Medizinische Wochenschrift.2006(1)

[4]Macrophage migration inhibitory factor（MIF）seems crucially involved in Guillain–Barrésyndrome and experimental allergic neuritis[J].Ferdinando Nicoletti,Alain Créange,David Orlikowski,Francis Bolgert,Katia Mangano,Christine Metz,Roberto Di Marco,Yousef Al Abed.Journal of Neuroimmunology.2005(1)

[5]张荣宜.巨噬细胞移动抑制因子在围植入期小鼠子宫内膜中的表达及其作用的研究[D].安徽医科大学,2009.