大鼠肝星状细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠肝星状细胞采用体外多步灌注和密度梯度离心法制备而来，α-SMA、Desmin呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

大鼠肝星状细胞

大鼠肝星形细胞主要类型

根据胶质丝的含量以及胞突的形状可将星形胶质细胞分为两种：

纤维性(大鼠肝星形细胞)星形胶质细胞（fibrous astrocyte）多分布在脑脊髓的皮质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝，又称蜘蛛细胞（spider cell）；

原浆性星形胶质细胞（protoplasmic astrocyte），多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。胞质内胶质丝较少，又称苔状细胞（mossycell）。

电镜下(大鼠肝星形细胞)星形胶质细胞的胞核有缺失，胞质较清亮，游离核糖核蛋白体和粗面内质网均很少，糖原颗粒丰富，有大量的胶质丝。纤维形星形胶质细胞的突起呈长圆柱形，而原浆性星形胶质细胞的突起呈薄片状，并常包裹着神经细胞及其突触（不伸入突触间隙）。星形胶质细胞的脚板与血管内皮细胞之间相隔一层基板，脚板质膜与基板接触处有半桥粒结构。

肝脏星形细胞(hepatic stellate cells,HSCs)，是肝脏的一种非实质细胞。该细胞位于Disse隙内，围绕在肝窦周围，其主要生理功能为摄取并储存维生素A。目前一致认为，激活的HSC为肝纤维化时产生各种细胞外基质(ECM)成分的主要细胞群。此外，激活的HSC还可能在门静脉高压的形成中发挥着重要作用。对HSC的功能特点及其激活调控机制的研究已成为近年来肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点之一。

应用^[4][5]

用于氧化低密度脂蛋白通过Wnt5a/PKCδ信号通路诱导大鼠肝星状细胞自噬研究

研究氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）自噬的影响及机制,探讨非酒精性脂肪性肝炎的发病机理。

方法:（1）体外培养HSC-T6细胞,剂量效应组用质量浓度（0、10、20、40、60μg/m L）的ox-LDL处理HSC-T6细胞24 h;时间效应组用20μg/m L的ox-LDL处理HSC-T6细胞0、3、6、12、24 h后,Western blot检测自噬相关蛋白LC3 II、Beclin1、p62的表达。

（2）不同质量浓度（0、10、20、40、60μg/m L）的ox-LDL处理HSC-T6细胞12 h后,Western blot检测通路相关蛋白Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3的表达。

（3）将HSC-T6细胞分为Control组、ox-LDL组、ox-LDL+si-NC组和ox-LDL+si-Wnt5a组。用Western blot、q RT-PCR分别检测LC3 II、Beclin1、p62、p-PKCδ、p-STAT3的表达;免疫荧光检测LC3 II荧光亮点的表达;油红O染色观察HSC-T6细胞脂滴含量变化;消化法检测HSC-T6细胞培养液中羟脯氨酸（Hyp）的含量;ELISA检测细胞培养液中透明质酸（HA）和层粘连蛋白（LN）的含量。

（4）PKCδ抑制剂Rottlerin预处理细胞:将HSC-T6细胞分为Control组、ox-LDL组、ox-LDL+DMSO组和ox-LDL+Rottlerin组。Western blot、q RT-PCR分别检测LC3 II、Beclin1、p62、p-STAT3的表达;免疫荧光检测LC3 II荧光亮点的表达;油红O染色观察HSC-T6细胞脂滴含量;消化法检测HSC-T6细胞培养液中羟脯氨酸（Hyp）的含量;ELISA检测细胞培养液中透明质酸（HA）和层粘连蛋白（LN）的含量。

结果:（1）经ox-LDL处理后HSC-T6细胞中LC3 II、Beclin1蛋白含量增加,p62降解增多,且在ox-LDL质量浓度为20μg/m L作用12 h达到峰值（P<0.05）。

（2）ox-LDL质量浓度为20μg/m L,作用12 h时HSC-T6细胞Wnt5a、p-PKCδ、p-STAT3蛋白表达显著升高（P<0.01）。

（3）敲低Wnt5a后,自噬相关蛋白LC3 II、Beclin1表达减少,p62降解减少,通路相关蛋白p-PKCδ、p-STAT3表达减少,细胞内LC3 II荧光亮点减少,脂滴含量减少,细胞培养液中Hyp、HA、LN含量也减少（P<0.05）。

（4）抑制PKCδ后,LC3 II、Beclin1表达减少,p62降解减少,通路相关蛋白p-STAT3表达减少,细胞内LC3 II荧光亮点减少,脂滴含量减少,细胞培养液中Hyp、HA、LN含量也减少（P<0.05）。

结论:（1）ox-LDL可诱导HSC-T6细胞自噬。（2）ox-LDL可促进HSC-T6细胞Wnt5a/PKCδ信号通路活化。（3）ox-LDL可能通过增强Wnt5a/PKCδ通路诱导HSC-T6细胞自噬。

参考文献

[1]Wnt signaling pathway in aging-related tissue fibrosis and therapies[J].He-He Hu,Gang Cao,Xia-Qing Wu,Nosratola D.Vaziri,Ying-Yong Zhao.Ageing Research Reviews.2020(prep)

[2]Intercellular crosstalk of hepatic stellate cells in liver fibrosis:New insights into therapy[J].Xuanyan Cai,Jiajia Wang,Jincheng Wang,Qian Zhou,Bo Yang,Qiaojun He,Qinjie Weng.Pharmacological Research.2020(C)

[3]The emerging role of Wnt5a in the promotion of a pro-inflammatory and immunosuppressive tumor microenvironment.[J].Lopez-Bergami Pablo,Barbero Gastón.Cancer metastasis reviews.2020(prep)

[4]Epidemiological Features of NAFLD From 1999 to 2018 in China.[J].Zhou Jianghua,Zhou Feng,Wang Wenxin,Zhang Xiao-Jing,Ji Yan-Xiao,Zhang Peng,She Zhi-Gang,Zhu Lihua,Cai Jingjing,Li Hongliang.Hepatology（Baltimore,Md.）.2020(5)

[5]侯明粟.氧化低密度脂蛋白通过Wnt5a/PKCδ信号通路诱导大鼠肝星状细胞自噬[D].山西医科大学,2021.