病毒RNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

病毒RNA提取试剂盒适合于从血清、细胞上清、淋巴液中提取RNA病毒基因组，不适合于细胞等组织内RNA病毒基因组的提取。使用本试剂盒提取的基因组RNA可用于RT-PCR实验。

病毒RNA提取试剂盒

操作步骤：

使用前请先在漂洗液中加入一瓶新开启的无水乙醇，加入到离瓶口约0.5-1cm距离，盖好摇匀。所有离心步骤均在2-8℃条件下进行。

1、取病毒上清液0.5ml，12000rpm离心5min，尽量吸尽上清使用，弃去沉淀（如无沉淀可省去此步）。

2、向病毒上清中加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化10min，期间可颠倒离心管混匀数次。

3、吸附柱前处理：从包装中取出吸附柱，放入收集管中，加入700ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12000 rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中待用。

4、向病毒上清中加入500ul结合液，充分混匀。再向管中加入400ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响RNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。（吸附柱的容积为750ul，可分两次加入。一次吸附完离心后再将余下的混合液体加入柱中静置离心。）

5、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃

废液，将吸附柱放入收集管中。

7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗

液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50ul-100ul经65℃水浴预热的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm离心2min。即可得到高质量的病毒基因组RNA。

应用^[4][5]

用于牛病毒性腹泻病毒持续性感染的分子机制研究及其定点突变株的构建研究

探索BVDV NADL调控宿主细胞MDBK的细胞自噬和凋亡通路及自噬改变对BVDV NADL复制影响的分子机制,并探索利用反向遗传学技术构建定点突变性BVDV毒株。

探索BVDV NADL影响MDBK细胞自噬的分子机制;探讨MDBK细胞自噬水平改变后对BVDV复制的影响;探究miR-29b对BVDV NADL感染诱导的细胞自噬及BVDV NADL复制的影响;分析miR-29b对MDBK细胞凋亡的影响。

方法:（1）BVDV NADL感染GFP-LC3质粒转染的MDBK细胞,在处理后不同时间,采用实时定量PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜和透射电镜等方法检测细胞自噬相关蛋白表达水平和自噬活性变化;并构建红色荧光标记的BVDV NADL三个糖蛋白Erns、E1和E2基因过表达的慢病毒,使用相同方法检测糖蛋白过表达对细胞自噬活性的影响;

（2）使用自噬抑制剂、促进剂和RNA干扰技术分别处理MDBK细胞,检测细胞自噬水平的变化;并使用BVDV NADL感染自噬活性改变的MDBK细胞,检测BVDV NADL mRNA水平变化;

（3）预测并鉴定miR-29b在自噬信号通路中靶基因ATG14和ATG9A;检测pre-miR-29b过表达的慢病毒和BVDV NADL感染后靶蛋白表达水平、细胞自噬水平及BVDV NADL复制水平;并设计ATG14和ATG9A回补实验,进一步验证miR-29b通过下调靶蛋白ATG14和ATG9A的表达,进而影响BVDV NADL感染诱导的细胞自噬水平和BVDV的复制;

（4）预测和鉴定miR-29b在凋亡信号通路中的靶基因NAIF1和caspase-7;检测miR-29b模拟物和抑制剂转染后MDBK细胞凋亡水平及caspase-7和NAIF1 mRNA和蛋白表达水平;并设计caspase-7和NAIF1回补实验,进一步证明miR-29b通过下调caspase-7和NAIF1的表达,进而影响凋亡水平。

参考文献

[1]Monitoring the bulk milk antibody response to bovine viral diarrhea in dairy herds vaccinated with inactivated vaccines[J].A.M.Gonzalez,I.Arnaiz,C.Eiras,F.Camino,M.L.Sanjuán,E.Yus,F.J.Diéguez.Journal of Dairy Science.2014(6)

[2]Expression differences of miRNAs and genes on NF-κB pathway between the healthy and the mastitis Chinese Holstein cows[J].Ling Chen,Xiaolin Liu,Zhixiong Li,Hongliang Wang,Yu Liu,Hua He,Jing Yang,Fubiao Niu,Lijun Wang,Jiazhong Guo.Gene.2014(1)

[3]Autophagy enhances the replication of classical swine fever virus in vitro[J].Jingjing Pei,Mingqiu Zhao,Zuodong Ye,Hongchao Gou,Jiaying Wang,Lin Yi,Xiaoying Dong,Wenjun Liu,Yongwen Luo,Ming Liao,Jinding Chen.Autophagy.2014(1)

[4]ATG9A overexpression is associated with disease recurrence and poor survival in patients with oral squamous cell carcinoma[J].Jen-Yang Tang,Edward Hsi,Ya-Chun Huang,Nicholas Chung-Heng Hsu,Yuk-Kwan Chen,Pei-Yi Chu,Chee-Yin Chai.Virchows Archiv.2013(6)

[5]付强.牛病毒性腹泻病毒持续性感染的分子机制研究及其定点突变株的构建[D].石河子大学,2015.