小鼠肺泡上皮细胞 MLE-12的应用

背景^[1-3]

小鼠肺泡上皮细胞MLE-12为HPV16E6、E7和ras基因共转化的C57BL/C(H-2b)小鼠肺上皮细胞，分离自小鼠肺泡上皮组织。

小鼠肺泡上皮细胞 MLE-12

细胞培养步骤：

培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于乙酰化修饰JAK2/STAT3对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化影响的机制研究

研究JAK2/STAT3信号通路对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化的影响。

方法：（1）复制小鼠肺泡上皮细胞间质转分化模型,依次用浓度为0.1umol/l、lumol/l、10umol/l的AngⅡ干预贴壁生长的MLE-12细胞,48h后收集蛋白,Western blot检测α-SMA表达,明确AngⅡ的干预浓度。

（2）将体外培养MLE-12细胞分为正常对照组、DMSO对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ+AG490组,正常对照组给予10ul PBS,DMSO对照组给予10umol/LDMSO+lumol/LAngⅡ,AngⅡ刺激组给予1 umol/L AngⅡ,AngⅡ+AG490组给予1 Oumol/L AG490+1umol/L AngⅡ,干预30min后收集蛋白,采用Western blot检测信号通路蛋白：JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）的表达水平。

（3）分组干预48h后收集蛋白,检测上皮细胞的标记物E-钙黏素（E-cadherin）,间质细胞的标记物平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及促纤维化因子TGF-β的表达,通过上皮向间质转分化的标记物,评估JAK2/STAT3信号通路在参与AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化过程中的作用。

（4）分组干预48h后,用CCK8法检测不同干预药物对MLE-12细胞活性的影响。

结果：（1）不同浓度AngⅡ对MLE-12细胞表达α-SMA的影响。与空白对照组相比,lumol/1 AngⅡ干预48h后MLE-12细胞表达的α-SMA显著增加（P<0.05）,继续增加AngⅡ干预浓度,MLE-12细胞表达的α-SMA未进一步增加,故本研究中采用lumol/l AngⅡ干预MLE-12细胞48h来复制肺泡上皮转分化模型。

（2）AngⅡ上调MLE-12细胞中JAK2/STAT3信号通路蛋白的表达。正常体外培养的MLE-12较少表达p-JAK2、p-STAT3,加入AngⅡ诱导30min后JAK2、STAT3无明显变化,而反应信号通路活化状态的p-JAK2、p-STAT3水平则明显升高（P<0.01）。

参考文献

[1]Role of the JAK/STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.Marrero Mario B,Banes-Berceli Amy K,Stern David M,Eaton Douglas C.American journal of physiology.Renal physiology.2006

[2]STAT-1 Signaling in Human Lung Fibroblasts Is Induced by Vanadium Pentoxide through an IFN-βAutocrine Loop.Aurita Antao-Menezes,Elizabeth A.Turpin,Phillip C.Bost,Jessica P.Ryman-Rasmussen,James C.Bonn.J.Immunol.2008

[3]Quality of Life,Pulmonary Function,and Tomographic Scan Abnormalities After ARDS.Joan R.Masclans,Oriol Roca,Xavier Munoz.Chest.2011

[4]Stat3 Dimerization Regulated by Reversible Acetylation of a Single Lysine Residue.Zheng-long Yuan,Ying-jie Guan,Devasis Chatterjee,Y.Eugene Ch.Science.2005

[5]卢森.乙酰化修饰JAK2/STAT3对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化影响的机制研究[D].东南大学,2015.