人主动脉内皮细胞的应用

背景^[1-3]

人主动脉内皮细胞（Human Artery Endothelial Cells）来源于成年人主动脉组织，其是组成主动脉腔面单层扁平上皮样细胞，大多呈梭形，它所产生和分泌的生物活性物质对维持血管张力，调节血压，抗血栓形成等有重要作用，在高血压，心、脑血管疾病的发病机制中有重要病理生理学意义。

人主动脉内皮细胞采用酶解法制备而来，vWF、Factor VIII呈阳性，细胞纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

内皮细胞构成了血管和其下组织的交界面。内皮细胞功能的变化是动脉粥样硬化的发病机理中的关键因素。内皮细胞能合成分泌凝血系统和纤溶系统中的活化因子和抑制因子，同时也能合成和分泌影响着血小板粘附和聚集的某些介质。内皮细胞还可以释放具有调控细胞增殖和血管壁张力功能的分子。

人主动脉内皮细胞能生成诸如t-PA和PAI-1等抗凝和血栓形成因子；在TNF-alpha的调节下，人主动脉内皮细胞能改变其生长特性，产生GM-CSF等细胞因子，在细胞表面表达ICAM-1，并产生大量的NO和内皮素。许多内皮水平的过程多可以通过内皮细胞的体外培养进行研究，因此，HAEC非常适用于研究和认识血管病变和衰老的分子机理。

应用^[4][5]

用于SIRT3基因干扰后对ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞ICAM-1、E-selectin表达的影响研究

探讨人SIRT3与内皮细胞损伤过程中炎性因子的调控关系,进一步揭示SIRT3在动脉粥样硬化发展过程中的作用。

研究方法1.干扰序列的筛选(1)人主动脉内皮细胞培养：人主动脉内皮细胞,用内皮细胞培养基+1%内皮生长因子+5%胎牛血清的培养液在37℃、5%CO2条件下贴壁培养,选择3-7代生长状态良好的细胞用于实验。

(2) 分组与转染：将生长状态良好的细胞随机分为空白对照组、阴性对照组、转染试剂对照组、SIRT3siRNA(1、2、3、4)组。待细胞70%-80%融合时用转染试剂hiperfect进行转染。转染试剂对照组只加转染试剂不加干扰序列。阴性对照组添加阴性对照序列和转染试剂。转染24h后检测相关指标。

(3) 显微镜观察细胞形态变化。

(4) 荧光倒置显微镜观察阴性对照组荧光蛋白表达。

(5) qRT-PCR检测各组SIRT3mRNA表达。

(6) Western blot检测各组SIRT3蛋白质的表达。

2、 SIRT3干扰后检钡ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞SIRT3mRNA,ICAM-1、E-selectin蛋白的表达。

(1) 实验随机分为空白对照组、siRNA组、(20、30、40μg/mL)ox-LDL组、siRNA+(20、30、40μg/mL)ox-LDL组。ox-LDL各组分别按浓度加入ox-LDL刺激6h；siRNA为筛选出的SIRT3干扰序列,siRNA+ox-LDL组为转染24h后加入ox-LDL刺激6h。

(2) qRT-PCR检测各组SIRT3mRNA的表达。

(3)流式细胞仪检测CAM-1、E-selectin抗体的平均荧光强度值。

结果1.干扰序列筛选结果(1)光学显微镜下,与空白对照组相比,SIRT3siRNA各组的细胞多数体积增大,细胞均质性降低,细胞间隙增大。这些特征在SIRT3siRNA2组较明显。

(3) 与光学显微镜下同一视野对比,阴性对照90%以上细胞显示绿色荧光。

(3)与各对照组相比,4条SIRT3siRNA序列均在不同程度上下调了SIRT3mRNA的表达(P均<0.05)。其中：SIRT3siRNA2组干扰效果,沉默效率为88.616%。(4)4个SIRT3siRNA组分别与各对照组相对灰度值相比,差异均有统计学意义(P均<0.05)。

参考文献

[1]Poly(ADP-ribose)polymerase inhibition prevents reactive oxygen species induced inhibition of aldehyde dehydrogenase2 activity[J].Shu-jian Wei,Jun-hui Xing,Bai-lu Wang,Li Xue,Jia-li Wang,Rui Li,Wei-dong Qin,Juan Wang,Xu-ping Wang,Ming-xiang Zhang,Yu-guo Chen.BBA-Molecular Cell Research.2013(3)

[2]The intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)gene polymorphism K469E in end-stage renal disease patients with cardiovascular disease[J].Monika Buraczynska,Wojciech Zaluska,Iwona Baranowicz-Gaszczyk,Kinga Buraczynska,Ewa Niemczyk,Andrzej Ksiazek.Human Immunology.2012(8)

[3]The role of endothelial cell adhesion molecules P‐selectin,E‐selectin and intercellular adhesion molecule‐1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal[J].Yang Su,Xi Lei,Lingyun Wu,Lixin Liu.Immunology.2012(1)

[4]Resveratrol Stimulates Cortisol Biosynthesis by Activating SIRT-Dependent Deacetylation of P450scc[J].Donghui Li,Eric B.Dammer,Marion B.Sewer.Endocrinology.2012(7)

[5]丁玲.SIRT3基因干扰后对ox-LDL刺激的人主动脉内皮细胞ICAM-1、E-selectin表达的影响[D].山东大学,2014.