PCR ENHANCER PCR增强剂的应用

背景^[1-7]

PCR ENHANCER PCR增强剂主要是由DMSO、Betaine、TMAC、Trehalose或其混合物组成，主要通过降低DNA的Tm值或/和增加Taq DNA聚合酶的稳定性来促进PCR。

PCR Enhancer是一种由多种成分组成的混合添加剂，在PCR反应中，PCR Enhancer能够有效降低高GC模板和具有复杂二级结构模板的解链温度，极大地减少DNA二级结构对PCR的影响，增加PCR反应的灵敏度和特异性，且兼容几乎所有DNA聚合酶的扩增体系。当优化PCR程序无法有效扩增目的片段时，加入PCR Enhancer往往能得到意想不到的结果。PCR ENHANCER PCR增强剂可能会降低PCR的保真度。因此，在进行高保真PCR时慎用。

常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。

1. DMSO：改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是当浓度高时（大于10％）时会降低保真性。

2.甘油：提高产量，增加酶的稳定性。

3.甲酰胺：促进某些“引物－模板”退火，降低带有二级结构的DNA的变性温度。

4.硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变DNA的变性及退火温度，调节酶活。

PCR增强剂常常在模板GC含量>70%,或者引物有二级结构的时候应用，使用增强剂可以打开这些结构，增加特异性，降低退火温度，但是会使产率降低，需要增加taq酶的量保证扩增的完成。

应用^[8][9]

用于PCR增效剂对体外长基因片段合成效率影响的研究

后基因组时代，基于全基因组序列的研究越来越多，这就要求研究者们能够在短时间内以最高的效率获得某一样品的全基因组序列。就技术而言，目前全基因组序列的体外获得主要是通过DNA体外拼接的方式完成，但大多数体外拼接方法都存在拼接长度有限、拼接效率低、步骤繁琐和成本高等缺点，本课题中采用的重叠延伸PCR和Gibson等温一步拼接法就是两种典型的DNA体外拼接技术，然而重叠延伸PCR拼接技术的应用受限于其拼接长度，而Gibson等温一步拼接法拼接片段长度虽然可以达到几百kb，但是其成本却很高，且拼接效率很低。近年来的一些研究成果表明纳米材料和核内小分子可以通过与DNA片段或DNA聚合酶相互作用，或者降低目的产物的Tm值等机制对DNA片段的PCR扩增起到增效作用。

设计了15对接头引物，利用这些接头引物扩增获得的短DNA片段之间可人为添加上一段overlaps，overlaps有40bp、80bp和202bp三种长度。这些短DNA片段进行拼接可获得长达6kb、10kb和27kb的长及超长DNA片段。小分子对重叠延伸PCR和Gibson Assembly拼接效率影响的研究及增效小分子的筛选，则首先通过测试小分子的使用浓度、反应条件、检测方法等实验参数建立了两种实验模型，然后将小分子添加在拼接体系中，通过观察各组的拼接效率判断各种小分子对两种拼接方法拼接效率的影响，从而筛选出了具有增效作用的小分子。最终筛选出了一种对GibsonAssembly具有增效作用的核内小分子，是23号肌苷；三种对重叠延伸PCR具有增效作用的核内小分子，分别为23号肌苷、29号异亮氨酸和32号缬氨酸；得到四种对重叠延伸PCR有增效作用的纳米材料，分别为18号羧基化短双壁碳纳米管、39号短多壁纳米碳管、48号羟基化的短多壁纳米碳管和53号羧基化短多壁碳纳米管。对于小分子增效机制的研究主要通过Q-PCR的方法进行测试。经初步研究发现小分子可以显著提高DNA扩增的特异性，并将基因片段的Tm值降低。

参考文献

[1]Betaine,Dimethyl Sulfoxide,and 7-Deaza-dGTP,a Powerful Mixture for Amplification of GC-Rich DNA Sequences[J].Marco Musso,Renata Bocciardi,Sara Parodi,Roberto Ravazzolo,Isabella Ceccherini.The Journal of Molecular Diagnostics.2006(5)

[2]Biochemical analysis and optimization of inhibition and adsorption phenomena in glass–silicon PCR-chips[J].Ivan Erill,Susana Campoy,Nadina Erill,Jordi Barbé,Jordi Aguiló.Sensors&Actuators:B.Chemical.2003(3)

[3]Fluorescence resonance energy transfer[J].Robert M Clegg.Current Opinion in Biotechnology.1995(1)

[4]Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides[J].Willem P.C.Stemmer,Andreas Crameri,Kim D.Ha,Thomas M.Brennan,Herbert L.Heyneker.Gene.1995(1)

[5]Enhancing PCR amplification and sequencing using DNA-binding proteins[J].Ralph Rapley.Molecular Biotechnology.1994(3)

[6]纳米材料作为Long PCR增效剂的研究[D].赵鑫.哈尔滨工业大学2011

[7]核内小分子对PCR增效作用的研究[D].赵鹤翔.哈尔滨工业大学2011

[8]纳米材料增强Long-PCR反应特异性的研究[D].孙书文.哈尔滨工业大学2010

{9]张双华.PCR增效剂对体外长基因片段合成效率影响的研究[D].哈尔滨工业大学,2013.